贵州大学王培义/吴红果CP：多聚半乳糖醛酸功能化的pH/酶双响应沸石咪唑酯骨架-8纳米农药系统用于油菜菌核病的防治

油菜（Brassica napus L.）作为全球第二大油料作物，是食用植物油与植物蛋白的重要来源，在农业生产体系中具有重要地位。其中，由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病（SSR）是我国油菜生产中的首要病害之一，常年发病率约为10%–20%，严重暴发年份可高达80%，对产量与品质造成显著影响。 当前防控仍以化学农药为主，但长期高频施用已导致防效下降与抗药性问题，同时传统制剂利用率低、环境残留风险高，亟需开发新型高效绿色农药体系。

从致病机制来看，核盘菌属于典型坏死营养型病原菌，其侵染过程中通过分泌草酸降低局部pH，同时产生多种细胞壁降解酶（CWDEs），尤其是多聚半乳糖醛酸酶（PGs），降解植物细胞壁果胶以实现侵入与定殖。 这种“酸性+高PGs”的特异性微环境为精准施药提供了重要靶点，但传统杀菌剂难以对此做出响应，限制了防控效果。近年来，纳米农药的发展为实现农药的靶向递送与可控释放提供了新路径，其中金属有机框架材料（MOFs）因高孔隙率、高载药量及良好生物相容性而备受关注。

在众多MOFs材料中，ZIF-8具有良好的pH响应特性，在中性或弱碱条件下结构稳定，而在酸性环境中可发生解体，实现药物释放，同时其降解产生的Zn²⁺还可促进植物生长。 基于此，研究进一步引入可被PGs特异降解的聚半乳糖醛酸（PG）作为功能涂层，从材料设计层面构建同时响应“酸性环境与酶信号”的双触发递送系统，以实现对病原侵染位点的精准控释。

针对上述科学问题，贵州大学绿色农药全国重点实验室王培义教授团队联合贵州大学药学院吴红果博士在国际知名期刊《Carbohydrate Polymers》上发表最新研究，研究团队构建了ZIF-8-NH₂@Hex@PG纳米农药体系：以氨基功能化ZIF-8为载体负载己唑醇（Hex），并通过PG包覆实现pH/酶双响应调控。 该系统在酸性与PGs存在条件下实现协同触发释放，显著提升抗菌活性（EC₅₀=0.086 μg/mL），在200 μg/mL下对核盘菌的预防与治疗效果分别达89.42%和76.67%，同时兼具优异的抗紫外、抗冲刷性能及良好生物安全性。 该研究为油菜菌核病的绿色高效防控提供了新的技术策略，也为智能响应型纳米农药的设计提供了重要参考。

实验方案

       研究采用后合成修饰结合一锅法构建纳米农药系统ZIF-8-NH₂@Hex@PG，具体流程包括：

       ZIF-8合成：以Zn(NO₃)₂·6H₂O和2-甲基咪唑为原料，在甲醇中反应制得ZIF-8纳米颗粒。氨基功能化：将ZIF-8活化后与3-氨基-1,2,4-三唑（Atz）反应，通过配体交换获得ZIF-8-NH₂。药物装载：在Atz配体交换过程中同时引入己唑醇，得到ZIF-8-NH₂@Hex。PG包封：以EDCI/NHS活化多聚半乳糖醛酸（PG）的羧基，与ZIF-8-NH₂@Hex表面的氨基形成酰胺键，最终制得ZIF-8-NH₂@Hex@PG。

       表征手段包括SEM、TEM、XRD、FT-IR、DLS、Zeta电位、TGA/DTG、BET比表面积和孔径分析、XPS等。生物活性测试涵盖体外菌丝生长抑制、离体叶片保护/治疗效果、广谱抗菌活性、杀菌机制探究（SEM/TEM观察、ROS测定、菌丝干重）。生物安全性评价采用HEK293细胞MTT试验、斑马鱼急性毒性、蚯蚓急性毒性、种子萌发及幼苗生长试验。

图. A) ZIF-8-NH @Hex@PG 纳米粒子的合成过程。  B) ZIF-8、ZIF-8-NH @Hex 和 ZIF-8NH @Hex@PG 纳米粒子的 SEM 和 C) TEM 图像。  D) ZIF-8-NH @Hex@PG 和 E) ZIF-8-NH @Hex 的 EDS 元素分布图。

表征分析

形貌与粒径： SEM和TEM显示纳米颗粒呈均一十二面体结构。ZIF-8-NH₂直径略大于ZIF-8，归因于Atz引入增加了表面氨基密度及壳层厚度。ZIF-8-NH₂@Hex由于Hex装载进一步增大直径。ZIF-8-NH₂@Hex@PG表面可清晰观察到PG包覆层且直径继续增大。DLS测得四者的水合粒径依次为256.61 ± 2.65 nm、297.05 ± 2.74 nm、300.46 ± 3.13 nm、343.58 ± 1.64 nm，与电镜结果一致。

Zeta电位： ZIF-8电位为+25.49 ± 0.86 mV，ZIF-8-NH₂升至+30.27 ± 0.12 mV（氨基质子化效应），Hex装载后降至+23.82 ± 0.78 mV，PG包封后进一步下降至−14.40 ± 0.82 mV（PG羧基的负电荷特性），表明PG成功包封。

XRD与FT-IR： 四种纳米颗粒均保留ZIF-8特征衍射峰但强度有所降低，表明各步修饰均降低了结晶度。FT-IR证实ZIF-8-NH₂中出现Atz的三唑环和氨基特征峰；ZIF-8-NH₂@Hex@PG在3328 cm⁻¹出现-C-N吸收带，同时检测到酰胺I带（1650 cm⁻¹，C=O伸缩振动）和酰胺II带（1550 cm⁻¹，N-H弯曲振动），证明酰胺键的形成及PG的成功化学连接。

EDS元素分析： ZIF-8-NH₂@Hex和ZIF-8-NH₂@Hex@PG不仅含有C、N、O、Zn元素，还含有Hex特有的Cl元素，确认了Hex的成功装载。

BET比表面积与孔结构： ZIF-8的BET比表面积为1773.40 m²·g⁻¹，孔容0.70 cm³·g⁻¹，孔径1.61 nm。氨基功能化后分别降至1379.43 m²·g⁻¹、0.62 cm³·g⁻¹、1.54 nm。Hex装载后比表面积和孔容进一步降至925.29 m²·g⁻¹和0.52 cm³·g⁻¹，孔径增大至1.67 nm，说明Hex有效占据了孔道空间。PG包封后各参数变化不明显。

TGA/DTG热稳定性： TGA 结果显示，所有纳米颗粒的热分解起始温度均高于 400℃，远高于己唑醇原药的分解温度（230℃），证明 ZIF-8 载体与 PG 涂层可显著提升己唑醇的热稳定性，满足农药加工与田间施用的环境要求。

XPS相互作用分析： ZIF-8-NH₂@Hex图谱中检测到Cl元素信号；O 1s谱中出现Zn-O新峰，且C=O峰向高结合能方向位移，表明Hex的C=O与ZIF-8-NH₂中的Zn发生了配位作用。N 1s谱证实氨基成功接枝（出现氨基N和偶氮N新峰）。PG包封后O 1s出现O-H峰，C=O结合能有所回落但仍高于纯Hex，反映酰胺键形成及Zn-O配位的共同影响。

载药量： 当ZIF-8-NH₂@Hex与PG摩尔比为1:1时，既能维持良好形貌，又获得较高载药量16.66 ± 0.48%。

图. ZIF-8、ZIF-8-NH、ZIF-8-NH@Hex和ZIF8-NH@Hex@PG的水合粒度分布、B)Zeta电位和C)X射线衍射图。D)ATZ，ZIF-8-NH和ZIF-8，E)ZIF-8-NH@Hex，Hex和ZIF-8-NH，F)ZIF-8-NH@Hex@PG，PG和ZIF-8-NH@Hex的红外光谱。G)不同摩尔比合成的ZIF-8-NH@Hex@PG。H)ZIF-8-NH₂@Hex@PG的载药量与合成比的关系。I)ZIF-8、ZIF-8-NH、ZIF-8-NH@Hex、ZIF-8-NH@Hex和ZIF-8-NH@Hex@PG纳米粒子的N吸附-脱附等温线、J)孔径分布、K)TGA曲线和Q)DTG曲线。

控释性能 

     在120小时持续释放实验中，ZIF-8-NH₂@Hex@PG表现出明显的pH和酶双重响应特性。 

pH响应：在pH 4.0条件下，Hex累积释放120 h达到79.21%，而在pH 7.0和pH 9.0条件下分别为57.12%和49%左右。酸性条件使ZIF-8-NH₂框架解体从而加速释放。纯98% Hex在不同pH下均13 h内近完全释放，无响应差异性。 

酶响应：在pH 7.0+PGs条件下，ZIF-8-NH₂@Hex@PG在初始6小时内即表现出显著加速释放，120 h累积释放率达69.76 ± 0.22%，远高于无酶条件下的57.12 ± 0.42%，说明PGs降解了外层PG壳层从而促进释药。

缓释对比：PG包封有效延缓了Hex释放。在pH 4.0条件下，ZIF-8-NH₂@Hex在11.5 h累积释放率达54.05 ± 0.09%，而ZIF-8-NH₂@Hex@PG仅为30.17 ± 0.30%。 

释放动力学：三种制剂的Hex释放均较好地符合一级动力学模型（R² > 0.84），其中ZIF-8-NH₂@Hex和ZIF-8-NH₂@Hex@PG的拟合精度（R² > 0.9094）显著优于纯药（R² = 0.8448）。Ritger-Peppas模型分析表明，ZIF-8-NH₂@Hex在所有条件下均为Fick扩散控制（n ≤ 0.45）。ZIF-8-NH₂@Hex@PG在pH 7.0和pH 9.0时亦为Fick扩散控制（n ≤ 0.45），但在pH 4.0和pH 7.0+PGs条件下表现为non-Fick扩散（0.45 < n < 0.89），即扩散与骨架溶蚀协同控释。 

紫外抗性： 254 nm紫外照射60 min后，ZIF-8-NH₂@Hex@PG的Hex保留率为54.03 ± 0.38%，显著高于ZIF-8-NH₂@Hex的48.30 ± 0.32%和98% Hex的34.70 ± 0.72%。ZIF-8-NH₂@Hex@PG的半衰期为64.77 min，是98% Hex（39.83 min）的1.6倍。ZIF-8框架和PG壳层共同起到了物理屏障、屏蔽紫外光的作用。

润湿与粘附性能

动态接触角： 去离子水在油菜叶片上的初始接触角为98°（疏水状态），120 s内无明显变化。ZIF-8-NH₂@Hex@PG初始接触角为83.5°（< 90°，亲水润湿），120 s内下降16.75°，表明PG涂层的亲水性极性基团（-OH、-COOH）在接触水后逐渐溶胀暴露，促进液滴持续铺展（。

叶片持液量（LHC）： ZIF-8-NH₂@Hex@PG的LHC为20.37 ± 3.08 mg/m²，显著高于ZIF-8-NH₂@Hex（14.23 ± 2.85 mg/m²）和10% Hex悬浮剂（10.98 ± 1.48 mg/m²）。

抗雨水冲刷： 荧光标记样品模拟雨水冲刷60 s和300 s后，荧光强度虽有所减弱，但仍可检测到强荧光信号，表明ZIF-8-NH₂@Hex@PG纳米颗粒能较好地附着于叶片表面微观结构中，具有一定抗冲刷能力。

图 . A) Hex 保留率和 B) 在 98% Hex、ZIF-8-NH @Hex 和 ZIF-8-NH @HexPG 中 230 nm UV 照射 60 分钟下 Hex 保留率的一阶动态拟合。  C) 润湿行为和 D) 120 秒内去离子水、ZIF-8NH @Hex 和 ZIF-8-NH @HexPG 液滴在油菜叶子上的动态接触角。  E) 油菜叶片上 10% Hex、ZIF-8-NH @Hex 和 ZIF-8NH @Hex@PG 的 LHC。

生物安全性

细胞毒性： HEK293细胞经ZIF-8-NH₂@Hex@PG处理（3.125–50 μg/mL）24 h或72 h，细胞存活率均 > 80%，而98% Hex仅在3.125 μg/mL处理24 h时存活率超过80%（83.13%），二者具有极显著差异（p < 0.001）。

斑马鱼急性毒性： ZIF-8-NH₂@Hex@PG在24、48、72、96 h的LC₅₀分别为29.85、28.01、24.15、20.67 mg/L，根据GB/T 31270.12-2014分类标准均属“低毒”（LC₅₀ > 10.0 mg/L）。10% Hex和98% Hex在四个时间段的LC₅₀范围为2.85–5.44 mg/L，均属“中等毒性”（1.0 < LC₅₀ ≤ 10.0 mg/L）。

蚯蚓急性毒性： ZIF-8-NH₂@Hex@PG的24 h LC₅₀为26.051 μg/cm²，属“中等毒性”（10 < LC₅₀ ≤ 100 μg/cm²）；10% Hex为3.159 μg/cm²，98% Hex为1.572 μg/cm²，均属“高毒性”（1 < LC₅₀ ≤ 10 μg/cm²）。

种子萌发与生长： ZIF-8-NH₂@Hex@PG在12.5–200 μg/mL各浓度下油菜种子发芽率与空白对照无显著差异（约55%），而10% Hex在100和200 μg/mL时发芽率分别下降。高浓度（200 μg/mL）连续灌根7天后，ZIF-8-NH₂@Hex@PG处理的油菜幼苗地上部分长度和重量均优于10% Hex处理组和空白对照组，可能与ZIF-8降解释放的Zn²⁺为植物提供营养、促进生长有关。

图. A) Hex 保留率和 B) 在 98% Hex、ZIF-8-NH @Hex 和 ZIF-8-NH @HexPG 中 230 nm UV 照射 60 分钟下 Hex 保留率的一阶动态拟合。  C) 润湿行为和 D) 120 秒内去离子水、ZIF-8NH @Hex 和 ZIF-8-NH @HexPG 液滴在油菜叶子上的动态接触角。  E) 油菜叶片上 10% Hex、ZIF-8-NH @Hex 和 ZIF-8NH @Hex@PG 的 LHC。